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\"Cryo-EM Incites a"Resolution Revolution,"Rousing Drug Discovery\"Copyright@Katarina Zimmer, GEN News蛋白质结构的解析是药物设计的关键。数十年来，利用X射线晶体学技术，药物开发者们成功实现了大量蛋白质的结构解析：X射线晶体学是一种利用X射线轰击蛋白质晶体，并对衍射出的图案加以分析，进而还原蛋白质三维结构的技术。这一技术揭示了蛋白质结构前所未有的细节，有时甚至能够达到1.2Å的原子级分辨率 。 在基于结构的药物设计领域，X射线晶体学至关重要。例如，通过对艾滋病（HIV）蛋白酶的结构研究，科学家们得以开发出一些能够治疗艾滋病的酶抑制药物。然而，X射线晶体学技术有一个致命的缺点：即进行结构解析的蛋白质必须处于结晶状态，而结晶是一个繁琐的过程。此外，并不是所有的蛋白质都能够结晶。 这时，冷冻电镜（cryo-EM）便能够发挥其作用。作为一项快速崛起的新技术，冷冻电镜无须对蛋白质结晶，便能够完成结构解析的流程。然而，由于技术的限制，冷冻电镜技术的成像分辨率较低，长期以来并不被真正地看好。 幸运的是，随着时间的推移以及技术的进步，科学家们设法提高了冷冻电镜的分辨率。基于更好的硬件和算法的发展，在2015年左右，多项技术的突破引发了冷冻电镜的分辨率革命。2020年，研究人员得到了去铁蛋白的1.25 Å结构，这表明了冷冻电镜技术也能够在原子细节上观察蛋白质。2017年的诺贝尔化学奖授予了科学家Jacques Dubochet、Joachim Frank和Richard Henderson，以表彰他们在开发冷冻电镜方面的工作，同时宣布冷冻电镜这项技术将结构生物学带入了一个新时代。 在制药界中，冷冻电镜已经成为解析蛋白结构的热门工具，特别是较大蛋白如膜蛋白家族的结构，而这恰好是X射线晶体学难以解决的领域：冷冻电镜显著扩大了基于结构的药物设计的蛋白质范围。与X射线晶体学相比，冷冻电镜的关键优势在于蛋白质不需要结晶，且蛋白质只需要在纯化的溶液中就能进行解析。蛋白质样品被急速冷冻后，电子显微镜利用电子束解析蛋白质的结构。然后使用计算方法将从不同角度拍摄的图像拼接起来。进而得到蛋白质的三维重建。 利用冷冻电镜进行基于结构的药物设计在如今可以实现更高分辨率的情况下，冷冻电镜的应用之一是确定靶向蛋白质的结构。其目的通常是在初期的药物设计过程中或在以后的过程中仔细检查候选药物如何与蛋白质结合，以更好地了解药物和靶点的相互作用。 膜蛋白和蛋白复合物是特殊的一类样品，它们对冷冻电镜结构解析有着强烈的需求，这些蛋白通常因为太大、柔性太高，或者数量太少而无法进行结晶。她指出，冷冻电镜的另一个优点是它不要求蛋白质在特定的环境中结晶，而科学家们可以利用这一优点，获取蛋白质的天然构象。 冷冻电镜结构解析的平均分辨率在2Å到2.5Å之间，这一结果低于X射线晶体学的平均分辨率。不过，计算模型可以用来优化蛋白质的原子结构模型。然而，冷冻电镜的最大挑战在于蛋白质样品的制备：通常这需要将靶点与其他分子结合起来，例如，柔性较高的蛋白质可能需要被加以稳定。经过恰当地样品处理后，冷冻电镜可以用于所有蛋白质的结构解析。冷冻电镜与基于片段的药物设计相遇总部位于英国剑桥的Astex制药公司在2016年开始尝试使用冷冻电镜。Astex与FEI（一家位于美国俄勒冈州的显微镜制造商）、英国医学研究委员会分子生物学实验室和剑桥大学纳米科学中心一起参与了一项帮助制药公司探索基于冷冻电镜进行早期药物发现研究的项目。 Astex公司的分子科学高级主管Pamela Williams博士说：“对我和我的同事们来说，要跳出舒适圈去学习冷冻电镜技术是十分艰难的。多年来，我们已经习惯于为X射线晶体学开发的高通量、自动化工作流程 。而冷冻电镜又是一种技术性极强的设备。”2020年，Williams博士及其同事进行了一项概念验证研究，并取得了鼓舞人心的结果。这项研究证明了冷冻电镜技术在Astex公司的专业领域—基于片段的药物设计方法中的效用。这种方法通过筛选小片段的方式，研究它们如何单独与蛋白质结合。其片段可以反复扩展，以建立一个能有效与蛋白质结合的分子。该研究表明冷冻电镜确实可以用来研究小片段和蛋白质之间的分子相互作用——在这种情况下，冷冻电镜解析出的热门肿瘤学靶点丙酮酸激酶的分辨率能够与X射线晶体学相媲美。 Astex公司正在利用冷冻电镜将基于片段的药物设计应用于膜蛋白靶点，如涉及中枢神经系统疾病的靶点。Williams博士认为冷冻电镜可以与X射线晶体学相结合。例如在设计破坏两种蛋白质之间结合位点的药物时，冷冻电镜可用于生成蛋白质复合物的图像，而X射线晶体学可用于单独获取每个蛋白质的详细外观。她坚持认为这两种技术有可能并肩工作。 解决冷冻电镜的数据存储问题Q uobyte公司是一家位于加州圣克拉拉的存储公司，其首席执行官Björn Kolbeck博士注意到了近年来许多生命科学领域数据的大幅增长，特别是冷冻电镜的数据。冷冻电镜需要积累许多高分辨率的蛋白质图像，因为这些图像是实现蛋白质的三维重建所必需的。Kolbeck指出，这比生命科学领域的其他成像技术所需的数据要多得多。 在这种情况下，拥有一个强大而高效的数据存储系统是至关重要的。它能与生成的数据量相适应，并且允许显微镜的连续运行和图像的快速处理。但对于使用冷冻电镜的科学家来说，在很多时候存储并不是当时需要考虑的事情。而许多人将他们的数据存储在单独的服务器上，因此如果系统发生了崩溃，那就会产生单点故障。小型制药和生物技术公司往往在一开始就将他们的数据存储在云端。Kolbeck认为这种方法很快就会变得非常昂贵，并且当数据需要从显微镜等现场设备中转移时，得到的效果并不理想。 而Quobyte的软件能做的更好，因为该系统本质上是将多个服务器的数据汇总到一个大的存储系统。这样一来就可以根据需要增加更多的服务器，而且如果一台服务器出现故障或需要维修，其存储仍然可用。

自两年前该公司开始宣传其用于冷冻电镜的软件以来，就引起了学术团体和药物开发商的兴趣。Kolbeck预测随着冷冻电镜的发展，数据存储的需求也将增长。他说：“从存储的角度来看，它的需求只会变得更大。”

冷冻电镜的未来赛默飞世尔科技公司高级总监兼制药业总经理Melanie Adams-Cioaba博士说，冷冻电镜技术确实有了长足的进步。赛默飞位于马萨诸塞州沃尔瑟姆，该公司提供一系列的实验室仪器和用品—包括冷冻电镜相关的仪器。该公司自2016年以来一直在销售冷冻电镜。2016年赛默飞收购了FEI公司，而FEI是开发电子显微镜的行业领导者。赛默飞提供的仪器包括Titan Krios显微镜，而这种显微镜在2020年拍摄了去铁蛋白标志性的原子级分辨率图像。 Adams-Cioaba博士指出，随着冷冻电镜技术的进步，该技术已被确立为应对难以结晶的靶点的首选方法，而现在冷冻电镜的应用也正在迅速发展。其中冷冻电镜的热门应用之一是对大型和灵活的生物制品（如治疗性抗体）进行成像。Adams-Cioaba博士补充说；“冷冻电镜能在任何我们真正想了解蛋白质结构的地方发挥作用，像蛋白质如何与其他蛋白质相互作用，以及这些蛋白质的变化如何影响蛋白质的功能。” 例如制药商可以使用冷冻电镜来帮助他们筛选针对某种特定蛋白质产生的大量抗体。这样的结构分析可以使其快速地按结构对抗体进行分类，并选择那些具有最大治疗前景的抗体。历史上，结构生物学很少在抗体开发的早期阶段被运用，其中部分原因因为是蛋白质不容易结晶。但由于冷冻电镜能够快速地进行结构解析，该技术允许结构生物学在这个过程中更早地指导抗体的开发。Adams-Cioaba博士预计，冷冻电镜将继续在药物开发中找到新的应用，而该领域的创新组合也将持续打破她的认知障碍。Adams-Cioaba还认为，冷冻电镜的无限可能性正受到人类的思维惯性和想象力的限制。

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Credit@Katarina Zimmer, GEN News

\"Cryo-EM Incites a "Resolution Revolution,"Rousing Drug Discovery\"

关键词： 射线晶体学 药物设计 数据存储